Se la membrana interna è così impermeabile, come entrano le proteine?

La membrana esterna dei mitocondri contiene la proteina della "porina". Questa forma un canale acquoso attraverso il quale possono passare proteine fino a 10,000 daltons ed entrare nello spazio intermembrane. In realtà, le piccole molecole effettivamente equilibrano la membrana esterna ed il  citosol. Comunque, la maggior parte delle proteine non possono entrare nella matrice se non passando attraverso la membrana interna. Questa membrana contiene cardiolipina che la rende virtualmente impermeabile. Ciò richiede meccanismi di trasporto attraverso la membrana che sono più organizzati e regolati. Una vista molto semplificata del processo è rappresentata in questa figura presa da Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition .

Segnali per l'importazione mitocondriale.

La maggior parte delle proteine deve essere srotolata o tirata per passare attraverso i translocatori. Questo coinvolge il legame dell'ATP ed è monitorato e stabilizzato dalle proteine chaperon, inclusa la hsp70. Pertanto, prima che la proteina possa passare attraverso il complesso TOM, essa deve diventare "traslocazione competente".  

Trasporto attraverso la membrana esterna: caratteristiche del complesso Tom.

Non sorprendentemente, il complesso TOM inncluderà l'importazione di recettori che inizialmente identificheranno il peptide segnale o una sequenza segnale (questi includono Tom20, Tom22, and Tom70).  Differenti proteine usano recettori diversi. Nel disegno sopra, il recettore è rappresentato come un ovale blu nel quale il peptide segnale viene inserito. I recettori allora portano proteina nella regione contenente il traslocatore delle proteine. Questo è in realtà un complesso di proteine.  
Esso viene chiamato Poro Importatore Generale (GIP) ed esso facilita la traslocazione delle presequenze della proteina attraverso la membrana esterna ( il GIP è costituito da Tom40, Tom5, Tom 6, and Tom7). Tom40 sembra essere l'elemento cruciale del poro e forma oligomeri (composto le cui molecole sono formate dalla unione di poche molecole semplici, dette monomeri; una proteina per es. è oligomerica quando ha struttura quaternaria ed è formata da poche catene polipeptidiche (es. emoglobina, lattico-deidrogenasi,.ndt.). Esso attraversa la membrana come una serie di 14 antiparalleli filamenti beta che formano un barile beta.Esso interagisce anche con la catena polipeptidica  passante attraverso il poro. Tutti gli altri componenti Tom nel GIP sono ancorati alla membrana esterna da segmenti transmembranali ad elica (ancoraggi idrofobici).

Studi recenti sul TOM40:  Rapport, D and Neupert W, Biogenesis of Tom40, Core Component of the TOM complex of mitochondria. J Cell Biol 146 321-332, 1999.  Studi focalizzati su come Tom40 entra nella membrana esterna e diventa una parte del GIP.  Lo studio riporta che: 

• Primo, come con molte proteine mitocondriali , Tom40 richiede chaperoni citosolici per prepararlo all'entrata. Nel caso di questa proteina, diventando "competente alla traslocazione" richiede ATP ed uno stato parzialmente ripiegato (il secondo è mediato dal chaperone citosolico (hsp70). 
• Secondo, quando è "competente", esso interagisce con il recettore di superficie, Tom20. Non c'è peptide segnale staccabile comunque, gli esperimenti mostrano che la necessità di un parziale ripiegamento suggerisce la presenza di informazioni obiettivo che si trovano in siti discontinui presi assieme nel dominio ripiegato.
• Alla fine l'inserzione è nei complessi Tom preesistenti. Questo richiede un N terminale intatto. 
• La dimerizzazione avviene successivamente entro la membrana.

Caratteristiche del Complesso Tim.

Le proteine mitocondriali destinate alla matrice spesso hanno un peptide segnale staccabile sulla proteina che deve essere identificato prima di venir immessa attraverso il traslocatore  mitocondriale. Queste proteine con un "segnali terminali aminici", o "preproteine" o "presequenze" usualmente interagiscono inizialmente con Tom20. Poi, esse devono attraversare la membrana esterna. Per fare ciò, esse sono trasferite al complesso GIP. Prima esse interagiscono con Tom22 e Tom5 che le accompagnano al poro formato da Tom40. Esse allora entrano nella matrice usando il complesso poro fatto da Tim23 e Tim17 che sono nella membrana interna. Inoltre, molto importante, la loro entrata dipende dal potenziale di membrana. Questo viene creato dai complessi di trasporto degli elettroni. Ricordando che gli ioni idrogeno sono stati pompati all'interno dello spazio intermembrane creando un gradiente di carica che è più negativo sul sito matrice. Questo potenziale di membrana effettivamente aiuta a trascinare la proteina nei canali Tim23-Tim17. La proteina entra allora nella matrice dove le preproteine staccabili vengono staccate da da una proteasi, MPP.   mt-hsp70 nella matrice lavorano con Tim44 per completare il pieno trasferimento alla matrice.  mthsp70 e Tim 44 realmente "tirano" la proteina dentro la matrice con un processo che richiede ATP.  Esso richiede anche il potenziale di membrana creato dalla catena di trasporto degli elettroni.

Alcune proteine mitocondriali destinate alla membrana interna hanno una presequenza staccabile seguita da uno o più segmenti membrano-passanti  idrofobici che funzionano come sequenze che interrompono il trasferimento nella membrana interna o, servono ad inserire il polipeptide entro la membrana interna dopo che arrivano.nella  matrice. Queste sono simili alle proteine della membrana Tipo I descritte nel capitolo sul reticolo endoplasmatico di tipo rugoso.

Comunque, altre proteine non hanno un segnale bersaglio separabile (Tipo II e III). Le proteine mitocondriali che hanno una sequenza segnale interna (gli esempi includono un certo numero di proteine nella membrana interna) generalmente interagiscono con Tom70 come recettore. Quindi, dopo che esse attraversano la membrana esterna via il complesso GIP, esse entrano nello speciale percorso Tim. Questo può comportare l'interazione con piccoli spazi intermembrana di Tim e Tim22-Tim54 della stessa membrana interna. 

Quelle proteine che non hanno una sequenza segnale obiettivo staccabile spesso hanno segnali con le seguenti caratteristiche: Esse hanno spesso uno stiramento di aminoacidi a carica positiva (talvolta adiacente a una regione idrofobica membrano-passante). Talvolta questi formano anse che fronteggiano la matrice. Ricordando che il "ruolo interno positivo" ha caricato positivamente gli aminoacidi concentrati dal lato citosolico per le proteine inserite nel reticolo endoplasmatico rugoso. Queste proteine mitocondriali tendono a seguire questa regola, solo se la matrice diventa il sito dove le cariche positive sono più numerose.

Esempi dalla letteratura:

Davis, AJ, Ryan, KR, and Jensen, RE  Tim23p contiene segnali distinti e separati per condurre ai mitocondri ed inserire entro la membrana interna.  Molecular Biology of the Cell 9: 2577-2593 (1999).

• Tim23 è una delle proteine di transizione di membrana interna. Esso non ha una presequenza amino-terminale. Le informazioni obietizzanti si manifestano nella proteina matura. 
• Tim23 ha 4 segmenti transmembranici e due anse cariche positive nella matrice. Cosa è necessario per segnalare una importazione?

• Rimpiazzare gli aminoacidi carichi positivamente in una o ambedue le anse con l'alanina residua. 
• Alla fine una di queste anse è necessaria per inserirsi nella membrana interna. 
• IL segnale per condurre ai mitocondri si trova negli ultimi due segmenti idrofobici transmembranali. 

Kurz, M, Martin, H, Rassow J, Pfanner, N, and Ryan, MT.  Biogenesi delle proteine Tim nei percorsi di trasporto e importazione nei mitocondri: meccanismi di obiettivo differenziati e di superamento nei processi di importazione importanti. Molecular Biology of the Cell 10: 2461-2474 (1999). Compara il ruolo di legame di tre proteine Tim  

• Tim54 porta un terminale amino, una sequenza di trasferimento non staccabile e carica positivamente. Comunque, è preferibile l'uso del Tom70 come suo recettore al posto di Tom20. Dopo il movimento attraverso il GIP, esso usa la sua sequenza terminale a carica positiva per entrare nella matrice. Esso richiede chaperoni ed ATP per entrare nella matrice.
• Tim22 è una proteina idrofobica che usa Tom20 per arrivare alla membrana esterna. Viene quindi seguita la via dei TIM per portare le proteine, uguale Tim23. Essi non richiedono hsp70 o ATP per entrare.
• Tim stretti si ritrovano normalmente negli spazi intermembranici e non sono proteine di membrana. Essi usanoTom20 come loro recettore e trasferitore ai complessi GIP. Comunque, quando Tom20 viene distrutto con la tripsina, disponendo del solo Tom5, i Tim stretti sono in grado di entrare. 

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La figura seguente è tratta da un altro testo di Lodish et al, Molecular Cell Biology. Essa mostra la intera sequenza di eventi necessari per introdurre una proteina nella matrice.

Step 1: La proteina si stende finchè si lega alla proteina chaperone hsp70. L'area rossa positiva indica la sequenza obiettivo. Il legame chaperone è dipendente dalla ATP

Step 2: La sequenza obiettivo si lega al recettore (solitamente Tom20)

Step 3: Il recettore accompagna la proteina al sito di traslocazione. Vengono coinvolte altre proteine Tom, ma Tom40 è il cuore del canale di translocazione.

Passo 4: La proteina viene introdotta stimolata dal potenziale di membrana. I complessi di trasporto degli elettroni sulla membrana interna hanno pompato H+ attraverso lo spazio intramembrane, lasciando la matrice più negativa. Questo attrae la proteina (il segnale è caricato positivamente). La proteina attraversa i translocatori Tim. Tim44 e hsp70 nella matrice continuano a guidare e spingere la proteina attraverso il poro. Un processo richiedente ATP.

Passo 5: un altro chaperone (chiamato chaperonina), hsp60 provoca il ripiegamento  della proteina nella sua sequenza terziaria. Un altro processo richiedente ATP.

Passo 6: La presequenza viene tagliata nella matrice.

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In un recente articolo di  Harkness et al (J Cell Biology 124: 637-648, 1995), essi hanno creato cellule di lievito mutate che includono un gene difettoso per MOM19.

Questo include inoltre un farmaco marcatore resistente così da potere fare crescere selettivamente cellule con il gene mutante ( in presenza del farmaco p=fluorophenyl alanine, o fpa). Così, che più a lungo le cellule crescono in presenza del farmaco, più cellule farmaco resistenti vengono trovate. La microfotografia al microscopio elettronico sopra riprodotta proviene dalla loro documentazioni (citate sopra). Queste mostrano il risultato dell'assenza della proteina MOM19 protein. Cosa manca nelle cellule cresciute per 16 o 32 ore in presenza del farmaco?

Se si esegue un esame delle proteine, quali proteine mancheranno ora? I test mostrarono che c'era un drammatico calo in molte delle catene respiratorie (atena di trasporto degli elettroni) inclusi i citocromi a/a3, e b. Comunque, il citocromo C era indenne. Questo suggerisce che deve essere importante un'altra proteina di controllo.

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Last updated: 01/20/08
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