WUSTL - Biopsia muscolare

Fondazione FONAMA

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Traduzione di Natale Marzari

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Giunzioni neuromuscolari, Nervi, Spinale, Atassia, Anticorpi e Biopsia, Informazioni per i pazienti

Monday 29 September 2008

Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza e la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale mi perseguita.
Natale Marzari

BIOPSIE MUSCOLARI

Metodi
Selezione dei muscoli per la biopsia
Procedure per la biopsia
Colorazioni
Modulo di richiesta per la biopsia

Clinica
Come leggere una biopsia muscolare
Indicazioni
Risultati: Diagnosi differenziale
Patologia: Indice
Sconosciute

Biopsia dei nervi

INDICAZIONI GENERALI PER LE BIOPSIE MUSCOLARI

Presenza di alcune evidenze di malattia muscolare
- Debolezza
- Sintomi muscolari: Sofferenza; Crampi; Fatica con l'attività (r/o miastenia)
- Creatina chinasi (CK) elevata (alta o molto alta)
- EMG miopatica
Presenza di una neuropatia per la quale è indicata una biopsia nervosa
Presenza di una malattia sistemica che possa coinvolgere in modo silente i muscoli
- Vasculiti
- Sarcoidosi
Non genericamente indicate in quelle malattie meglio diagnosticate con metodi elettrodiagnostici
- Miastenia grave (può essere consigliata una biopsia se le colorazioni esterasi delle NMJ sono esili)
- Miotonie
Aspettare: 1 mese dopo un episodio di rabdomiolisi

SELEZIONE DEI MUSCOLI PER LA BIOPSIA

Malattia cronica: Muscoli con debolezza moderata, ma non grave
Malattia acuta: Muscoli con debolezza moderata o grave
Muscoli più specifici: Deltoide; bicipiti; quadricipiti
Si può eseguire una MRI per selezionare il sito patologico muscolare nei casi difficili
Evitare: I muscoli che sono stati oggetto di EMG, iniezioni,o trauma

PROCEDURE PER LA BIOPSIA

Tecnica: Noi usiamo quasi sempre la procedura a biopsia aperta per il prelievo di muscolo
- Biopsia aperta è fortemente indicata per malattie con patologia non uniforme, per es. polimiositi
- Non usare cauterio, suture, o punti
- Alcuni laboratori usano aghi per molte biopsie per minimizzare il trauma
  - Si possono perdere le patologie non uniformi o epimisiali
- Prelevare numerosi campioni dal sito della biopsia: Specialmente con possibili
  - Malattia multifocale: Miopatie infiammatorie
  - Necessari per analisi metaboliche
Trasporto
- Muscoli possono essere conservati in garze con soluzione salina per molte ore
- Tenere il campione al freddo.
- Muscoli NON devono essere immersi in liquidi salini, fissativi o altri
- Muscoli congelati possono essere spediti in sicurezza "con corriere rapido" con adeguato ghiaccio secco
Conservazione
- Congelamento la maggior parte dei tessuti in isopentano preraffreddato a -160^oC in azoto liquido.
  - Muscoli congelati per l'istochimica presentano
    - Eccellente morfologia delle fibre muscolari
    - La migliore informazione diagnostica al microscopio ottico
  - Il processo di congelamento deve avvenire rapidamente per prevenire artefatti.
  - Conservare i muscoli congelati a -80^oC.
- Fissare alcuni campioni muscolari in glutaraldeide al 4%
  - Inglobare in plastica la maggior parte dei muscoli fissati
    - Per le analisi subcellulari, se necessarie
    - Buona visualizzazione dei capillari endomisiali muscolari
  - Materiale inglobato in paraffina
    - Utile per controllare l'infiammazione e la morfologia delle cellule infiammatorie
    - Fornisce poco sulla morfologia delle fibre muscolari

COME LEGGERE UNA BIOPSIA MUSCOLARE

Questioni generali da ricordare

Le fibre muscolari sono anomali?

Muscolo normale: Diametro medio delle fibre
Età anni	Diametro μM
Nascita	15
1	18
3	20
6	27
8	35
10	40
12	50
Adulti	≥ 60

Dimensione: Sottili o grosse
Sagoma: Arrotondata o spigolosa
Tipo: Raggruppanti; Tipo di fibre predominanti
Architetture interna: Disordinata o persa; Vacuoli; Nuclei interni; Inclusioni
Materiale accumulo, o in accumulazione: Glicogeno; Lipidi; Mitocondri

Il processo patologico è

Neurogeno o miopatico?

Sagoma delle fibre muscolari sottili

Rotonda: Miopatico
Spigolosa: Neurogeno
Eccezioni

Atrofia di tipo 2 ® fibre sottili spigolose
Atrofia muscolare spinale ® fibre sottili arrotondate

Distribuzione delle fibre atrofiche

Raggruppate: Denervazione; Distrofinopatie
Sparse: Neuropatia o miopatia acute

Distribuzione dei tipi di fibre

Tipo raggruppante: Denervazione cronica
Predominanza di tipi di fibre

Malattia congenita
Neuropatia demielinizzante
Fibre grosse di tipo ragruppante

Tipo di fibre assottigliate

Tipo 1 sottili: Miopatie ereditarie
Tipo 2 sottili: Malattie acquisite; MG congenita

Acuta o cronica?

Acuta

Miopatia: Fibre muscolari con degenerazione e rigenerazione
Neuropatia: Fibre muscolari spigolose sottilii

Cronica

Miopatia: Tessuto connettivo endomisiale aumentato; Fibre muscolari ipertrofiche
Neuropatia: Fibre di tipo raggruppante; Grumi nucleari picnotici

Caratteristiche producenti diagnosi specifiche?

Quale è la distribuzione della patologia?
- Uniforme (simile in tutte le parti della biopsia): Distrofia; Fibre di tipo atrofiche
- Regionale
  - Alterazioni a zone fascicolari: Miopatia infiammatoria; Denervazione focale
  - Gruppi di fibre muscolari
- Fibre muscolari sparse: Miopatia acuta; Neuropatia acuta
Le caratteristiche sono diagnostiche?
- Si tratta di infiammazione o cellularità eccessiva?
  - Quale genere?
    - Linfociti
    - Macrofagi
    - Altro: Neoplasmia; Eosinofilia
  - Dove?
    - Endomisiale
    - Perimisiale
    - Perivascolare
    - Invasione focale delle fibre muscolari
- Si tratta di accumulo di materiale?
  - Lipidi
  - Glicogeno
  - Amiloidi
- Si tratta di patologia in strutture diverse dalle fibre muscolari?
  - Vasi
  - Tessuto connettivo: Endomisiale; Perimisiale
  - Nervi intramuscolari

COLORAZIONI NELLE BIOPSIE MUSCOLARI

Categoria	Metodo	Utilità
Morfologia	Ematossilina ed eosina	Patologia delle fibre muscolari; Nuclei
	Verhof van Giesson (VvG)	Tessuto connettivo; Struttura dei vasi Nervi intramuscolari
	Tricromia di Gomori	Tessuto connettivo; Bastoncelli nemalinici
Tipizzazione delle fibre	ATPasi miofibrillare, alcuni pH	Fibre muscolari tipo ragruppante e atrofia
	ATPasi pH 9.4	Perdita di miosina; Atrofia delle fibre di tipo 1 o 2
	ATPasi pH 4.6	Fibre muscolari di tipo 2B
	ATPasi pH 4.3	Fibre muscolari di tipo 2C (immature)
Enzimi: Ossidativi	NADH-TR	Architettura interna delle fibre muscolari; Aggregati tubulari; Cuori
	Succinato deidrogenasi	Patologia mitocondriale
	Citocromo ossidasi	Patologia mitocondriale
Enzimi: Glicolitici	Fosforilasi	Carenza enzimatica
Enzimi: Glicolitici	Fosfofruttochinasi	Carenza enzimatica
Enzimi: Idrolitici	Fosfatasi acida	Macrofagi; Lisosomi; Lipofuscina
	Esterasi non specifica	Macrofagi; Lisosomi; Giunzioni neuromuscolari e miotendiniche Fibre muscolari denervate (spinose sottili)
	Acetilcolinesterasi	Giunzioni neuromuscolari e miotendiniche
	Fosfatasi alcalina	Fibre muscolari rigeneranti; Malattia immunitaria del tessuto connettivo
Accumulo di materiale	PAS	Glicogeno; Carboidrati
	Blu alciano	Mucopolisaccaridi
	Sudan nero B	Lipidi
	Sudan III	Lipidi
Altro	Rosso Congo	Amiloidi; Infiammazioni; Vacuoli
	Mioadenilato deaminasi	Livelli enzimatici
	Pironina metile verde	RNA
	Arancio acridina	RNA
	Von Kossa	Calcio
Muscolo fissato	Blu di toluidina	Fibre muscolari; Capillari

BIOPSIE MUSCOLARI RISULTATI: Diagnosi differenziale

Fibre muscolari
Danneggiamento
Architetture interna
Mitocondriale
Necrosi
Cambiamenti dimensionali
Atrofia
Ipertrofia
Accumulo
Tipi di malattie
Vacuoli
Nuclear changes
Capillary patologia

Amiloidi

Patologia dei capillari
Complementi
Fibrosi endomisiale
Infiammazioni
Miopatie ereditate
Proteine citoplasmatiche
Proteine extracellulari
Proteine nucleari
Proteine sarcolemmali
Patologia nucleare

Invasione focale delle fibre muscolari

Atrofia (H&E; ATPasi): Vedi anche tipi di malattia delle fibre
- Fibre sottili arrotondate: Miopatia (Rigenerazione; Cronica); Tipo I assotigliate
- Fibre sottili spigolose: Neuropatia; Atrofia di tipo 2; Miopatie con inclusione di corpi
- Raggruppate: Neuropatia con denervazione
  - Molti gruppi sottili: Più comunemente associata alla SLA
  - Gruppi grossi: Denervazione cronica; Malattia del motoneurone
  - Fuori ruolo: Miopatica ragruppante
- Perifascicolare: Dermatomiositi
Ipertrofia
- Fibre di tipo I: Atrofia muscolare spinale
- Fibre di tipo II: Esercizio
- Fibre di tipo misto
  - Parziale denervazione: Molto cronica
  - Miopatie croniche: Distrofia muscolare
Danneggiamento delle fibre muscolari
Patologia nucleare (H&E)
- Grumi picnotici
  - Denervazione cronica senza reinnervazione
  - Distrofia miotonica, Tipo II
  - Miastenia grave, chronic non trattata
- Nuclei interni
  - Più abbondanti e > 60% delle fibre: Distrofia miotonica cronica
  - Singola, collocata centralmente: Miopatia centronucleare
  - 10% a 30% delle fibre: Cronica neuropatica o Processo miopatico
- Nuclei anormali: Miosite con inclusione di corpi
- Grossi nuclei: Fibre muscolari rigeneranti; Miopatia con perdita di miosina
Infiammazioni (H&E; Rosso congo; Fosfatasi acida; Esterasi; Immunocitochimica)
- Miopatie immunitarie
  - Cellule T > macrofagi
    - Spesso con invasione focale delle fibre muscolari
    - Malattie specifiche: Miosite con inclusione di corpi; Miositi con malattia mitocondriale
  - Macrofagi predominanti
- Vasculiti: Cellule T > macrofagi
- Distrofia FSH: Cellule T
- Sarcoide: Macrofagi e istiociti nel centro dell'infiammazione granulomatosa
- Necrosi delle fibre: Macrofagi nelle fibre muscolari
- Linforragia (Miastenia grave): Cellule T
Fibrosi endomisiale (H&E; GT e VvG)
- Diffuse e abbondanti
  - Distrofia
  - Stadio finale muscolare
  - Miopatia da anti-SRP
- A zone: Miopatia acquisiat
- L'aumento del tessuto connettivo endomisiale fra le fibre muscolari è normale in regioni con NMJ
Anormale architettura interna delle fibre (Colorazione NADH)
- Obiettivi: Denervazione e reinnervazione; Tenotomia
- Cuori: Sindrome del nucleo centrale
- Grossolana: Fibre immature o in rigenerazione
- Bastoncelli (Colorazione GT): Miopatia con bastoncelli; Reinnervazione con obiettivi
- Aggregati tubulari
- Fibre Moth-eaten: Malattia sistemica del tessuto connettivo; Distrofia cronica
- Anelli
- Fibre lobate: LGMD 2A; Cmd di Ulrich; Miopatia di Bethlem
- Necrosi
Malattia dei tipi di fibre (ATPasi pH 9.4, 4.6 e 4.3)
- Assenza di colorazione ATPasi miosinica a tutti i pH: Miopatia con carenza di miosina
- Tipo ragruppante: Denervazione cronica con reinnervazione o crescita collaterale
- Tipo 1
  - Predominanza di tipo 1
    - Tutte tipo 1: Malattia del nucleo centrale; Fibre grosse tipo ragruppante; Neuropatie demielinizzanti
    - La maggior parte tipo 1: Atrofia muscolare bulbospinale
  - Fibre sottili di tipo 1:
    - Distrofia: Emery-Dreifuss; ?Miotoniche
    - Miopatie congenite: Centronucleare; Bastoncelli nemalinici; Disproporzione fra tipi di fibre
  - Tipo 1 grosse: Atrofia muscolare spinale 5q
- Tipo 2
  - Fibre di tipo 2 sottili: Disuso; Invecchiamento; Perdita di peso; Malattia sistemica; Paraneoplastica
  - Fibre di tipo 2 grosse: Allenamento all'esercizio
  - Fibre di tipo 2A assenti o sottili: IBM3
Mitocondriali (SDH e citocromo ossidasi)
- Patologia: Diagnosi differenziale
Accumulo di glicogeno (PAS)
Accumulo di lipidi (Sudan nero oppure Sudan III)
Vacuoli
- Lisosomali: Carenza di maltasi acida; Malattia di Batten
- Autofagici
  - Istologia: Si può colorare per esterasi e proteine sarcolemmali
  - Malattie
    - Vacuoli autofagici con caratteristiche sarcolemmali
    - Vacuoli autofagici: Altro
- Perossisomi: Malattia di Lafora
- Orlati
  - Miosite con inclusione di corpi
  - Distrofia muscolare oculofaringeale (OPMD)
  - Miopatie distali
  - Miopatie con inclusione di corpi ereditarie
    - HIBM: 1, 2, 3
    - Miopatia + Paget e demenza
  - LGMD: 1A, 1G, 2G
  - Emery-Dreifuss, collegata al cromosoma X
- Subsarcolemmale: Carenza di fosforilasi
- Altre: Paralisi periodica; Accumulo di glicogeno; Accumulo di lipidi; Miopatia centronucleare;
  Lipofuscin (invecchiamento); Artefatto da congelamento; Accumulo di desmina
Amiloide (rosso Congo)
Deposizione di poliglucosani: Aumento della sintetasi glicogenica: Rapporto degli enzimi ramificanti
Deposizione di complementi: Modelli
- Capillari muscolari
- Dentro le fibre muscolari: Necrosi delle fibre muscolari
- Attorno le fibre muscolari: Cause variabili
Patologia dei capillari
Immunoistochimica: Miopatie ereditate¹

Proteine citoplasmatiche
Proteine extracellulari
Proteine nucleari
Proteine sarcolemmali
- Molecole extracellulari
  - Laminine
    - Catena γ1 della laminina: Controllo per la valutazione della membrana basale nelle malattie della lamina basale
    - Laminina α2 (Merosina)
      - Normale: Diffusamente presente sulla lamina basale e nervi IM
      - Assente
        
        Distrofia muscolare congenita
        
        Associata con ridotte laminina β2, distroglicano α e integrina α7
      - Ridotta
        
        Primaria: Miopatia
        
        Secondaria: FKRP (LGMD 2I, CMD + ipertrofia muscolare, MEB, sindrome Walker-Warburg
    - Laminina β1: Ridotta nella miopatia di Bethlem
  - Collagene
    - Miopatia di Bethlem: Collagene VI colorazione normale; Laminina β1 ridotta
    - Distrofia muscolare congenita di Ullrich: Collagene VI colorazione ridotta nel muscolo e capillari
  - Perlecan: Ridotta o normale nella sindrome di Schwartz-Jampel
- Proteine relative al sarcolemma
  - Distrofina
    - Utilità dell'esaminazione
      - Diagnosi: Quando l'esame genetico è equivoco o negativo
      - Prognosi: Migliore con più distrofina residua
    - Metodi di esaminazione e risultati
      - Anticorpi: 3 usati, vs terminale C, bastoncini e terminale N dei domini della distrofina
      - Immunocitochimica
        
        Distrofina assente: Alta specificità per i difetti del gene distrofina
        
        Ha specificità per la DM di Duchenne
        
        Spesso a tutti 3 gli anticorpi
        
        Terminale C sempre colpito nella DM di Duchenne
        
        Distrofina ridotta: Non specifico per i difetti del gene distrofina
        
        Può aversi nella DM di Becker
        
        Può aversi colorazione a chiazze di singole fibre del sarcolemma
        
        Terminale C solitamente preservato nella DM di Becker
        
        Perdita selettiva del dominio dei bastoncini può produrre il fenotipo Duchenne
        
        Si trova anche in alcune malattie dei sarcoglicani e della disferlina
        
        Distrofina normale: Non esclude un difetto del gene distrofina
        
        Può aversi nella DM di Becker
        
        Fibre muscolari revertite
        
        Definizione: Colorazione di gruppi isolati o piccoli di fibre con più distrofina delle altre
        
        Dovuto alla 2a mutazione producente delezione "in-frame": Prodotte molecole di distrofina piccole
      - Western blot: Utile per
        
        Scoprire distrofina di dimensioni ridotte
        
        Scoprire distrofina di 2 differenti dimensioni nei portatori
        
        Confermare il ridotto quantitativo di distrofina
  - Distroglicano α: Secondariamente ridotto in alcune distrofie muscolari congenite (CMD) e LGMD
    - Malattie FKRP
      - CMD con ipertrofia muscolare e CNS normale (MDC1C)
      - LGMD 2I
    - Altre distrofie muscolari congenite (CMD)
      - CMD di Fukuyama
      - CMD con insufficienza respiratoria e ipertrofia muscolare (CMD1B; MDC1B)
      - CMD con grave ritardo mentale (MDC1D)
      - Malattia muscolo-occhi-cervello (MEB; Santavuori)
      - DM congenita di Walker-Warburg
    - HIBM2 (Nonaka)
  - Sarcoglicani
    - Assenti: Assenza selettiva di 1 sarcoglicano ha specificità per la mutazione in quel gene
    - Ridotti
      - Mutazioni in 1 sarcoglicano tende a ridurre i livelli di altri sarcoglicani
      - Mutazione sarcoglicana γ: I sarcoglicani β e δ possono essere normali
  - Disferlina
    - Disferlina assente in entrambi IHC e Western blot: Ha specificità per LGMD 2B
    - Disferlina ridotta: Non-specifica; Malattie della distrofina (50%), sarcoglicani (20%), caveolina3 e calpaina3
    - Western blot mostra una correlazione più forte con i difetti del gene
  - Caveolina 3
    - LGMD-1C: Ridotta colorazione nella membrana
- Proteine citoplasmatiche: Solubili e Miofibrillari
  - Actina: Si possono presentare accumulazioni nelle
    - Miopatia nemalinica: Malattie della actina
    - Miopatia congenita con eccesso di filamenti sottili
  - Proteine della banda Z
    - Bastoncini nemalinici: Colorati da actinina α; telethonina; miotilina
    - Miotilina: Accumulo anormale con alcune mutazioni (Miopatia miofibrillare)
    - Telethonina: Assente nella LGMD 2G
  - Miosina: Fibre tipizzanti
  - Titina: IHC non utile per la diagnosi della LGMD 2J o della Miopatia distale
  - Calpaina 3
    - IHC: Non utile nell'esaminazione per la LGMD 2A
    - Western blot
      - Calpaina 3 assente: Ha specificità per la LGMD 2A
      - Calpaina 3 ridotta: Può aversi nella LGMD 2A, 2B, 2I, 2J
  - Desmina
    - Accumulazioni intracellulari: Marcatore per le miopatie miofibrillari
    - Altre proteine associate nelle accumulazioni: Distrofina, CDC2 chinasi, β-APP, Proteina prionica, NCAM e Miotilina
- Proteine nucleari
  - Emerina: Colorazione assente nella cute e nel muscolo nella EDMD 1
  - Lamina A/C: IHC non utile; Western blot può dimostrare ridotto quantitativo nella EDMD 2

Vedi: Indice delle patologie

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Riferimenti
1. J Neuropath Exp Neurol 2005;64:181-193

27 settembre 2006

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