If mitocondri sono incubati in un oxygraph apparato (ossigeno electrode) in un isotonic medium contenenti substrato e fosfato, then aggiunta of ADP causa a sudden burst of ossigeno apporto come the ADP è convertita into ATP:
La actively respiring state è talvolta refered to come "state 3" respiration, while the slower rate dopo all the ADP è stata phosphorylated to form ATP è refered to come "state 4".
State 4 respiration è solitamente più rapido than the original rate before il primo aggiunta of ADP because alcuni ATP è broken down by ATPasi attività contaminating the preparation, e the resulting ADP è then re-phosphorylated delle intact mitocondri.
La ratio [state 3 rate] : [state 4 rate] è chiamato the respiratoria controllo index e indicates the tightness del accoppiamento fra respiration e fosforilazione. With isolata mitocondri the accoppiamento è non perfect, probably come risultato of mechanical danneggiamento during the isolazione procedure. Typical RCI valori range from 3 to 10, varianti con la substrato e the quality del preparation. Coupling è pensato essere meglio in vivo, ma may still non achieve 100%.
E' possible to calculate a P:O ratio (la relazione fra ATP synthesis e il consumo di ossigeno) by measuring the diminuzione in ossigeno concentration during the rapida burst of state 3 respiration dopo aggiungendo a known amount of ADP. E' necessary to subtract the basal respiration dovuta a imperfect accoppiamento e the recycling of ATP, come shown nel graph sopra. Lo scambio in concentration must then be multiplied delle chamber volume, so che la answer (in micro-atoms of ossigeno) can be related al quantity of ADP aggiunsero. La quantity of ossigeno nel chamber è calculated from pubblicati ossigeno solubility data a the appropriate temperature. Using the figures dai graph sopra:
diminuzione in O2 (from graph) = 0.135 mM; chamber volume = 2.5ml
ossigeno atoms consumed in state 3 = 0.135 * 2 * 2.5 = 0.68 micro-atoms (note the factor of 2, allowing per 2 atoms in un ossigeno molecule)
injected ADP (20 microlitres di un 50mM solution) = ATP formed = 1 micromole in total
P:O = [ATP formed] : [ossigeno consumed] = 1.48 (per succinato oxidation)
NAD-collegato substrates give consistently più alto valori per the P:O ratio (about 2.5) comparate con succinato (about 1.5). Questo provoca indicano che elettroni from relativamente scarse reducing agents tipo la succinato (anche acil CoA e glycerol fosfato) enter part del way lungo the catena respiratoria, by-passing il primo accoppiamento site where energia è captured per ATP synthesis.
La sharp changes in slope dopo exhaustion of ADP e again dopo all the ossigeno sono state usate up imply che mitocondri must hanno very high affinities per ADP e ossigeno. La concentration of Entrambi queste compounds è molto bassa nella maggior parte healthy cellule, sino they sono efficiently scavenged delle mitocondri.
La aggiunta di un disaccoppiamento agent (tipo la dinitrophenol o CCCP) porta in una permanently high rate of respiration nel assenza of ADP, fino a all the ossigeno è stata consumed.
Molte natural e synthetic poisons block mitocondriale respiration. If mitocondri sono incubati in un oxygraph experiment con substrates e inorganic fosfato, the interactions fra inibitori e uncouplers allow due major types of inibizione essere distinguibili:
| mitocondriale respiration rates | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| additions / inibitori | none | oligomycin | cyanide | |||
| none | bassa | bassa | zero | |||
| ADP | high | bassa | zero | |||
| disaccoppiamento agent | high | high | zero | |||
La conclusion essere drawn from questo type of experiment è che cyanide prevents respiration by blocking the catena respiratoria in se, so cyanide è effective whether o non ADP o uncoupler sono aggiunsero. Oligomycin on the altri hand inibisce the ADP fosforilazione system, so it solo blocks respiration in accoppiate mitocondri.
Registrazioni dell'elettrodo dell'ossigeno (oxygraph)
Se i mitocondri sono incubati in un'apparecchiatura del
oxygraph (elettrodo dell'ossigeno) in un substrato ed in un fosfato
contenenti medi isotonici, allora l'aggiunta dell'ADP causa un burst improvviso
del consumo
d'ossigeno mentre l'ADP è convertito in trifosfato di adenosina:
Attivamente il respiro dichiara è a volte refered a come
"dichiari" respirazione 3, mentre il tasso più lento dopo che tutto l'ADP sia
fosforilato
formare il trifosfato di adenosina è refered a come "dichiari
4".
Dichiari 4 che la respirazione è solitamente più veloce del
tasso originale prima della prima aggiunta dell'ADP perché un certo
trifosfato di adenosina è analizzato dalle attività dell'ATPasi che
contaminano la preparazione, e l'ADP risultante è allora re-fosforilato dai
mitocondri intatti.
Il rapporto [ dichiari il tasso 3 ]: [ dichiari il tasso 4 ] è denominato
l'indice di controllo
respiratorio ed indica la strettezza dell'accoppiamento fra la
respirazione e la fosforilazione. Con i mitocondri isolati l'accoppiamento non è
perfetto, probabilmente come conseguenza di danni meccanici durante la procedura
di isolamento. RCI tipico stima la gamma da 3 a 10, variando con il substrato e
la qualità della preparazione. L'accoppiamento si pensa per essere più meglio in
vivo, ma può però non realizzare 100%.
È possibile calcolare una P:Il rapporto della O (il rapporto fra la sintesi del
trifosfato di
adenosina ed il consumo dell'ossigeno) misurando la diminuzione nel
tenore in ossigeno durante il burst veloce di dichiara la
respirazione 3 dopo la aggiunta della quantità conosciuta di ADP. È necessario
da sottrarre la respirazione basale dovuto
l'accoppiamento imperfetto ed il riciclaggio del trifosfato di
adenosina, come indicato nel grafico qui sopra. Il cambiamento nella
concentrazione deve allora essere moltiplicato
per il volume dell'alloggiamento, in moda da potere collegare la risposta (in
micro-atomi di ossigeno)
con la quantità di ADP aggiunta. La quantità di ossigeno nell'alloggiamento è
calcolata dai dati
pubblicati di solubilità dell'ossigeno alla temperatura adatta. Usando le figure
dal grafico qui sopra:
faccia diminuire in O2 (dal grafico) = 0.135 millimetri; volume
dell'alloggiamento = 2.5ml
gli atomi di ossigeno consumati dentro dichiarano 3 =
0.135 * 2 * 2.5 = 0.68 micro-atomi (noti il fattore di 2, tenendo conto 2 atomi
in una molecola dell'ossigeno)
l'ADP iniettato (20 microlitres di una soluzione di 50mM) =
trifosfato di adenosina ha formato = 1 micromole nel totale
P:O = [ trifosfato di adenosina formato ]: [ ossigeno consumato ] = 1.48 (per
ossidazione del succinato)
i substrati NAD-collegati danno i valori costantemente più
alti per la P:Il rapporto della O (circa 2.5) ha paragonato a succinato (circa
1.5). Questi risultati indicano che gli elettroni dagli agenti riduttori
relativamente poveri quale succinato (anche acilico CoA e fosfato
del glicerolo) forniscono la parte del senso lungo la catena
respiratoria, escludendo il primo accoppiamento situi dove l'energia è bloccata
per
la sintesi del trifosfato di adenosina.
Lo sharp cambia nel pendio dopo che l'esaurimento dell'ADP e dopo che
tutto l'ossigeno sia stato esaurito implichi ancora che i mitocondri
debbano avere affinità molto alte per l'ADP e l'ossigeno. La concentrazione di
entrambi questi residui è molto bassa in la
maggior parte delle cellule sane, poiché sono puliti efficientemente dai
mitocondri.
L'aggiunta di un agente disgiungente (quali dinitrofenolo o CCCP)
conduce ad un tasso permanente alto di respirazione in assenza
dell'ADP, fino a tutto l'ossigeno è stato consumato.
Molti veleni naturali e sintetici ostruiscono la respirazione
mitocondriale. Se i mitocondri sono incubati in un esperimento del oxygraph con
i
substrati ed il fosfato inorganico, le interazioni fra gli inibitori ed i
uncouplers permettono che due
tipi importanti di inibizioni siano distinti:
Tassi respiratori mitocondriali
aggiunte/ inibitori
nessun
oligomycin
cianuro
nessun
basso
basso
zero
ADP
alto
basso
zero
disgiungere agente
alto
alto
zero
La conclusione da disegnare da questo tipo di esperimento è
che il cianuro impedisce la respirazione ostruendo la catena
respiratoria in se, così il cianuro è efficace se o non l'ADP o il uncoupler è
aggiunto. Oligomycin d'altra parte inibisce il sistema di fosforilazione di
ADP, così ostruisce soltanto la respirazione in mitocondri coppia.
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Pagina originale: www.bmb.leeds.ac.uk/illingworth/oxphos/oxigraph.htm
